體外診斷試劑參考區(qū)間確定注冊(cè)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)醫(yī)療器械注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料中參考區(qū)間研究資料的準(zhǔn)備及撰寫(xiě)，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門(mén)審評(píng)注冊(cè)申報(bào)資料提供參考。

本指導(dǎo)原則是對(duì)體外診斷試劑參考區(qū)間確定的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供醫(yī)療器械注冊(cè)申請(qǐng)人和技術(shù)審評(píng)人員使用的指導(dǎo)文件，但不包括審評(píng)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但應(yīng)提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)體系及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)體系的不斷完善和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

本指導(dǎo)原則適用于定量檢測(cè)體外診斷試劑參考區(qū)間的確定研究。本文主要討論健康人群相關(guān)的參考區(qū)間，申請(qǐng)人也可用類(lèi)似方法建立其他類(lèi)型參考人群的參考區(qū)間，如其他特定生理或病理?xiàng)l件的參考區(qū)間。

本指導(dǎo)原則不適用于定性和半定量檢測(cè)試劑；不適用于藥物濃度監(jiān)測(cè)用途的檢測(cè)試劑；不適用于致病性病原體相關(guān)檢測(cè)試劑；不適用于醫(yī)學(xué)決定水平的確定。已經(jīng)有國(guó)內(nèi)公認(rèn)、統(tǒng)一的參考區(qū)間和醫(yī)學(xué)決定水平的檢測(cè)項(xiàng)目，可不再建立參考區(qū)間，此類(lèi)產(chǎn)品應(yīng)將評(píng)估重點(diǎn)放在標(biāo)準(zhǔn)化方面。

本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行相關(guān)產(chǎn)品注冊(cè)和變更注冊(cè)的體外診斷試劑參考區(qū)間確定，包括申報(bào)資料中的部分要求，其他未盡事宜，應(yīng)當(dāng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》（國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局令48號(hào)）（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《辦法》）等相關(guān)法規(guī)要求。

二、基本原則

應(yīng)按照以下情況,分別選擇建立和驗(yàn)證的方式確定申報(bào)產(chǎn)品的參考區(qū)間：

1.首個(gè)申報(bào)產(chǎn)品（境內(nèi)無(wú)同類(lèi)已批準(zhǔn)上市注冊(cè)產(chǎn)品）

1.1境內(nèi)申報(bào)產(chǎn)品應(yīng)通過(guò)建立的方法，確定申報(bào)產(chǎn)品的參考區(qū)間。

1.2進(jìn)口申報(bào)產(chǎn)品，如在境外申請(qǐng)人注冊(cè)地或者生產(chǎn)地所在國(guó)家（地區(qū)）已批準(zhǔn)上市，申請(qǐng)人需驗(yàn)證申報(bào)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)載明的參考區(qū)間的適用性。如驗(yàn)證不通過(guò)，需建立適用于中國(guó)人群的參考區(qū)間。未在境外申請(qǐng)人注冊(cè)地或生產(chǎn)地所在國(guó)家（地區(qū)）上市的創(chuàng)新醫(yī)療器械，應(yīng)建立包含中國(guó)人群參考區(qū)間。

2.國(guó)內(nèi)已有同類(lèi)產(chǎn)品批準(zhǔn)上市的申報(bào)產(chǎn)品，可選擇自行建立參考區(qū)間，也可以選擇驗(yàn)證該產(chǎn)品境外注冊(cè)試劑說(shuō)明書(shū)中的參考區(qū)間（進(jìn)口注冊(cè)適用），或其他國(guó)內(nèi)已注冊(cè)產(chǎn)品參考區(qū)間，但應(yīng)首選注冊(cè)申報(bào)中臨床試驗(yàn)或臨床評(píng)價(jià)中方法學(xué)比對(duì)時(shí)，所選擇的對(duì)比試劑的參考區(qū)間進(jìn)行驗(yàn)證。如驗(yàn)證通過(guò)，可直接采用經(jīng)驗(yàn)證的參考區(qū)間；如驗(yàn)證不通過(guò)，應(yīng)建立參考區(qū)間。

上述參考區(qū)間的驗(yàn)證應(yīng)滿足下文“（二）參考區(qū)間的驗(yàn)證”章節(jié)相關(guān)條件；參考區(qū)間的建立應(yīng)滿足下文“（一）參考區(qū)間的建立”章節(jié)相關(guān)要求。

三、技術(shù)審查要點(diǎn)

（一）參考區(qū)間的建立

1.參考樣本組的選擇

1.1制定參考個(gè)體的選擇標(biāo)準(zhǔn)

篩選參考個(gè)體時(shí)，應(yīng)首先確定檢測(cè)項(xiàng)目的適用人群，除成年表觀健康人外，適用時(shí)，也應(yīng)考慮納入未成年人（如評(píng)估生長(zhǎng)發(fā)育的指標(biāo)）或老年人（如評(píng)估衰老相關(guān)疾病的指標(biāo)），絕經(jīng)前和絕經(jīng)后表觀健康女性個(gè)體（如部分女性相關(guān)腫瘤標(biāo)志物、骨代謝標(biāo)志物等），不同月經(jīng)周期女性（如性激素）等；對(duì)于特定體液樣本類(lèi)型，如腦脊液，可考慮將非相關(guān)病理人群的特定評(píng)估指標(biāo)作為參考個(gè)體的篩選標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)根據(jù)申報(bào)產(chǎn)品個(gè)性化定義“表觀健康”，評(píng)估可能的生理及病理影響因素，據(jù)此設(shè)定明確的納入、排除標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)依據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)參考個(gè)體調(diào)查問(wèn)卷，并采取必要的措施保證問(wèn)卷填寫(xiě)的準(zhǔn)確、客觀。

綜上，針對(duì)不同檢測(cè)項(xiàng)目參考個(gè)體的排除標(biāo)準(zhǔn)也不盡相同，表1中列出應(yīng)予以考慮的部分排除因素，申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目的不同，增加或減少排除標(biāo)準(zhǔn)。

表1 參考個(gè)體選擇應(yīng)考慮的排除因素

1.2制定參考個(gè)體的分組標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)所篩選參考個(gè)體的特征，考慮其是否對(duì)臨床決策具有意義等情況，對(duì)其進(jìn)行分組。研究者應(yīng)根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目的不同，合理設(shè)計(jì)分組條件。潛在分組條件可以是年齡、性別、血型、種族、晝夜節(jié)律、飲食、吸煙、運(yùn)動(dòng)、月經(jīng)周期、妊娠階段、采樣時(shí)間、地理位置、職業(yè)等因素。

1.3 參考個(gè)體的選擇

參考個(gè)體選擇時(shí)，應(yīng)按照明確的標(biāo)準(zhǔn)采用直接抽樣的方式進(jìn)行選擇。參考個(gè)體應(yīng)盡可能接近檢測(cè)項(xiàng)目的臨床患者分布組成，盡可能涵蓋各年齡組內(nèi)不同年齡段，且男女個(gè)體數(shù)量應(yīng)相當(dāng)(適用時(shí)），地域選擇應(yīng)具有代表性。參考個(gè)體分布特征應(yīng)盡量接近社區(qū)人群分布。注冊(cè)申請(qǐng)人根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)設(shè)計(jì)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，將符合標(biāo)準(zhǔn)的具有人群代表性的個(gè)體納入?yún)⒖既巳?。建議通過(guò)多中心招募的形式納入?yún)⒖既巳骸?/p>

2.樣本采集與處理

2.1參考個(gè)體準(zhǔn)備

參考個(gè)體的狀態(tài)指對(duì)檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果具有影響的狀態(tài)。樣本采集前進(jìn)食會(huì)對(duì)許多檢測(cè)項(xiàng)目有直接（濃度改變）或間接（脂類(lèi)物質(zhì)干擾）的影響，長(zhǎng)期節(jié)食也會(huì)造成許多檢測(cè)指標(biāo)的改變。另外，咖啡因、酒精、香煙和維生素C等，也會(huì)對(duì)許多檢測(cè)項(xiàng)目的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，應(yīng)該對(duì)參考個(gè)體各項(xiàng)可能產(chǎn)生影響的因素（表2）進(jìn)行評(píng)價(jià)，保證狀態(tài)良好方可進(jìn)行樣本的采集。

表2 參考個(gè)體的狀態(tài)因素

2.2樣本的采集、處理和儲(chǔ)存

影響參考樣本采集、處理和儲(chǔ)存的因素包括采樣環(huán)境、采樣時(shí)間、采樣體位、樣本類(lèi)型、運(yùn)送方式、樣本狀態(tài)、樣本分離、儲(chǔ)存方式等。申請(qǐng)人應(yīng)采用符合說(shuō)明書(shū)聲稱(chēng)要求的樣本進(jìn)行參考區(qū)間研究，并在研究報(bào)告中詳細(xì)說(shuō)明樣本類(lèi)型、儲(chǔ)存方式等情況。如檢測(cè)采用血液樣本，應(yīng)區(qū)分動(dòng)脈血、靜脈血及毛細(xì)血管血；如需使用抗凝劑，需明確抗凝劑的類(lèi)型；如采集尿液樣本應(yīng)明確取樣時(shí)間段（如適用）。

3.樣本檢測(cè)

應(yīng)采用檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行參考樣本的檢測(cè)。檢測(cè)系統(tǒng)包括樣本處理用產(chǎn)品、檢測(cè)試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、檢測(cè)設(shè)備等。

4.數(shù)據(jù)分析

依據(jù)臨床意義的不同，參考區(qū)間研究需要確定檢測(cè)項(xiàng)目的單側(cè)界值或雙側(cè)界值。通常使用雙側(cè)2.5%～97.5%人群分布，單側(cè)時(shí)可選擇95%或5%。

4.1參考樣本數(shù)量

研究至少需要120例參考樣本,此時(shí)可對(duì)參考限的90%置信區(qū)間進(jìn)行準(zhǔn)確估計(jì)。參考限的置信區(qū)間不同，所需參考樣本量也不盡相同，具體見(jiàn)表3。如需分組評(píng)估，則每組均需要滿足相應(yīng)置信區(qū)間的參考樣本量要求。如有離群值，則應(yīng)在剔除離群值后補(bǔ)足相應(yīng)參考樣本例數(shù)。 

表3 95%參考區(qū)間的不同置信區(qū)間最少樣本數(shù)量

 4.2繪制分布圖

繪制分布圖用以了解數(shù)據(jù)分布特征，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行審查。

為了解數(shù)據(jù)的分布特性，需對(duì)數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布進(jìn)行判斷，即數(shù)據(jù)對(duì)稱(chēng)性和正態(tài)峰的判斷。數(shù)據(jù)對(duì)稱(chēng)性和正態(tài)峰的判斷可通過(guò)直方圖、正態(tài)概率圖，或采用假設(shè)檢驗(yàn)的方法進(jìn)行綜合判斷，常用的假設(shè)檢驗(yàn)方法有矩法、W檢驗(yàn)法、KS檢驗(yàn)法等。

4.3數(shù)據(jù)離群值的判斷

申請(qǐng)人應(yīng)采用合理的統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行離群值的判定。此處推薦兩種方法：

4.3.1 Dixon方法（適用于非正態(tài)分布數(shù)據(jù)）

4.3.1.1在參考值檢測(cè)數(shù)據(jù)中，如果有疑似離群數(shù)據(jù)，應(yīng)將疑似離群值的檢測(cè)結(jié)果和其相鄰值的差D和數(shù)據(jù)（包含疑似離群值）全距R相除，若D/R≥1/3考慮為離群值。

4.3.1.2若同側(cè)有2個(gè)或以上疑似離群點(diǎn)，可從最小的疑似離群點(diǎn)起作如上處理，若D/R都大于1/3，則所有疑似點(diǎn)都定義為離群值；若D/R都小于1/3，則保留所有疑似數(shù)據(jù)。

4.3.2 Tukey法（適用于正態(tài)分布數(shù)據(jù)）

4.3.2.1 計(jì)算數(shù)據(jù)集的四分位數(shù)，定義為Q3（75%分位數(shù)）和Q1（25%分位數(shù)）。計(jì)算四分位間距，定義為IQR(Q3-Q1)。將大于四分位間距上限：Q3+1.5×IQR或小于四分位間距下限：Q1-1.5×IQR的參考值定義為離群值。

4.3.3如出現(xiàn)離群值，應(yīng)對(duì)離群值產(chǎn)生原因進(jìn)行分析，如果有明確的原因，如檢測(cè)時(shí)操作錯(cuò)誤等，可將離群值剔除，如無(wú)明確原因，應(yīng)將該數(shù)據(jù)保留。

4.4數(shù)據(jù)分組

數(shù)據(jù)是否需要分組，需根據(jù)參考區(qū)間分組是否對(duì)臨床決策具有意義或檢測(cè)項(xiàng)目具有明確的生理學(xué)意義，且必須對(duì)不同亞組之間的差別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)假設(shè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果應(yīng)顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合數(shù)據(jù)分布特征選擇適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)假設(shè)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分組判定。如數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，申請(qǐng)人可采用Z檢驗(yàn)，確定分組后的均值間差異有無(wú)統(tǒng)計(jì)上的顯著性。

式中，

1——第一組參考值的均值

2——第二組參考值的均值

s1 ——第一組參考值的標(biāo)準(zhǔn)差

s2 ——第二組參考值的標(biāo)準(zhǔn)差

n1——第一組參考值的數(shù)量

n2 ——第二組參考值的數(shù)量

n——平均樣本量

如s2＞1.5s1或s2/（s2-s1）＜3時(shí)，可以考慮分組；如計(jì)算Z值超過(guò)Z*時(shí)，也可考慮成分組。

4.5建立參考區(qū)間

依據(jù)數(shù)據(jù)分布特征，計(jì)算參考區(qū)間的常用方法包括參數(shù)法和非參數(shù)法。

4.5.1經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后，如參考值數(shù)據(jù)近似正態(tài)分布或檢測(cè)數(shù)據(jù)經(jīng)變量轉(zhuǎn)換后呈正態(tài)分布，可采用正態(tài)分布法確定參考區(qū)間，樣本量要求見(jiàn)表3。用該方法確定的參考區(qū)間所得結(jié)果穩(wěn)定，受兩端數(shù)據(jù)影響較小。

可采用下述公式進(jìn)行參考區(qū)間的計(jì)算：

雙側(cè)1-α參考區(qū)間：`X±Z1-α/2S

單側(cè)1-α參考區(qū)間：＞`X -Z1-αS或＜`X＋Z1-αS

式中`X為均數(shù)，S為標(biāo)準(zhǔn)差。

4.5.2經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后，如參考值數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，可采用百分位數(shù)法（非參數(shù)法）確定參考區(qū)間，樣本量要求見(jiàn)表3。該方法受兩端數(shù)據(jù)影響較大，樣本含量較小時(shí)結(jié)果不穩(wěn)定、不宜選用。將n個(gè)參考個(gè)體檢測(cè)值按照從小到大的順序排列，并依次編上秩次。把n個(gè)秩次分為100等分，與r%秩次對(duì)應(yīng)的數(shù)稱(chēng)為第r百分位數(shù)，用Pr表示。分別計(jì)算參考值下限r(nóng)1（2.5百分位數(shù)）和參考值上限r(nóng)2（97.5百分位數(shù)）作為檢測(cè)項(xiàng)目的95%參考區(qū)間。還需計(jì)算參考限的90%或95%置信區(qū)間。若r值計(jì)算值不是整數(shù)，可將它們四舍五入后取整。

（二）參考區(qū)間的驗(yàn)證

1.驗(yàn)證條件

采用驗(yàn)證的方法確定申報(bào)試劑參考區(qū)間時(shí)，需要滿足以下條件：第一，原始參考區(qū)間的研究應(yīng)系統(tǒng)全面，具有可信性，如已發(fā)布實(shí)施的臨床檢測(cè)參考區(qū)間標(biāo)準(zhǔn)等;第二，檢測(cè)系統(tǒng)需具有可比性；第三，參考區(qū)間研究的分析前因素需具有可比性，如參考個(gè)體的狀態(tài)，標(biāo)本采集和處理程序等; 第四，參考人群的適宜性。原始參考區(qū)間研究所采用的參考人群應(yīng)在人群分布的地理位置、人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征等方面與申報(bào)試劑預(yù)期適用人群相一致，或包含符合參考區(qū)間建立參考樣本數(shù)量要求的上述參考人群。如不能同時(shí)滿足上述條件，申請(qǐng)人需按照前文所述方法建立自己的參考區(qū)間。

申請(qǐng)人應(yīng)通過(guò)方法學(xué)比對(duì)的方法，對(duì)申報(bào)產(chǎn)品與原始參考區(qū)間建立時(shí)的檢測(cè)系統(tǒng)的可比性進(jìn)行研究。方法學(xué)比對(duì)研究方法，可參考《免于臨床試驗(yàn)的體外診斷試劑臨床評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》（國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2021第74號(hào)公告）。注意兩檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果應(yīng)具有高度一致性。申請(qǐng)人應(yīng)通過(guò)列表的方式，對(duì)比參考人群分布的地理位置、生物特征、參考區(qū)間研究分析前的因素等。

2.參考區(qū)間的驗(yàn)證

申請(qǐng)人應(yīng)選擇至少20例與申報(bào)產(chǎn)品預(yù)期使用人群地理分布和人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征相似的參考個(gè)體，在具有與原始參考區(qū)間研究一致的分析前因素和相同的檢測(cè)條件下，研究小樣本人群的參考值。比較小樣本參考值和原始參考區(qū)間之間的可比性。如果20例參考個(gè)體中只有不超過(guò)2例的參考值超出原始參考區(qū)間，即通過(guò)驗(yàn)證，可以直接使用原始參考區(qū)間。如參考個(gè)體多于20例，則超出原始參考區(qū)間的數(shù)據(jù)不超過(guò)檢測(cè)結(jié)果的10%，即通過(guò)驗(yàn)證；若有10%以上的數(shù)據(jù)超出原始參考區(qū)間，則應(yīng)另選至少20例參考個(gè)體，重新按照上述判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行驗(yàn)證。若參考區(qū)間驗(yàn)證使用了其他參考界值，則對(duì)應(yīng)的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)需滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求的。若驗(yàn)證結(jié)果符合要求，可直接使用原始參考區(qū)間，反之則應(yīng)檢查所有的分析程序，考慮樣本是否有生物學(xué)差異，并按照前文所述方法建立自己的參考區(qū)間。

在統(tǒng)計(jì)學(xué)上，隨著樣本量的增加，利用統(tǒng)計(jì)原理發(fā)現(xiàn)人群差異的能力更強(qiáng)。因此，申請(qǐng)人可以加大參考個(gè)體的樣本量，如采用60例樣本，并將測(cè)得的參考值與原始參考區(qū)間比較，判斷參考值和原始參考區(qū)間之間是否具有可比性。

（三）說(shuō)明書(shū)

申請(qǐng)人應(yīng)在說(shuō)明書(shū)【參考區(qū)間】中載明經(jīng)研究確定的參考區(qū)間。此部分內(nèi)容應(yīng)包含參考區(qū)間確定的基本信息，包括：樣本量、參考人群特征（如性別、年齡、種族等）和參考區(qū)間確定采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。

四、其他應(yīng)注意的問(wèn)題

無(wú)論是建立自己的參考區(qū)間或驗(yàn)證參考區(qū)間，都要確保參考區(qū)間的可溯源性，記錄確定參考區(qū)間的所有步驟，包括參考個(gè)體的選擇、分析前因素、樣本檢測(cè)以及統(tǒng)計(jì)分析方法等。

五、名詞解釋

1.參考個(gè)體（reference individual）：根據(jù)明確標(biāo)準(zhǔn)選擇出進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的個(gè)體。通常是符合特定標(biāo)準(zhǔn)的健康個(gè)體。

2. 參考人群（reference population）：由所有參考個(gè)體組成的群體。

注：通常情況下參考人群中的個(gè)體數(shù)是未知的，因此參考人群是一個(gè)假設(shè)實(shí)體。

3.參考樣本組（reference sample group）：從參考人群中選出的用以代表參考人群的足夠數(shù)量的個(gè)體。

4.參考值（reference value）：通過(guò)對(duì)參考個(gè)體某一特定量進(jìn)行觀察或測(cè)量而得到的值（檢驗(yàn)結(jié)果）。

5.參考分布（reference distribution）：一組參考值的分布。

6.參考限（reference limit）：源自參考值的分布，用于描述部分參考值的位置（小于或等于、大于或等于、上限/下限）。

7.參考區(qū)間（reference interval）：來(lái)自生物參考人群的數(shù)值的特定分布區(qū)間。

注：在有些情況下，只有一端的生物學(xué)參考界限是重要的，通常是上限“x”，相應(yīng)的參考區(qū)間將是小于或等于“x”。

六、參考文獻(xiàn)

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